|
Prezenta glicocalixului la suprafata celulelor a fost evidentiata la microscopul electronic prin metode de citochimie ultrastructurala atat nespecifice (adica metode care evidentiaza structura fara a aduce indicii referitoare la compozitia lui biochimica), cat si specifice (metode care permit descrierea, cel putin partiala, a bichimiei structurii). Ca exemplu de metoda nespecifica amintim folosirea rosului de ruteniu. Acest compus interactioneaza cu sarcinile negative de la nivelul glicocalixului impregnand grosimea acestuia cu nucleii grei al ruteniului si conferind structurii electrono opacitate. Putem caracteriza prin aceasta metoda glicocalixul sub aspectul grosimii sale si a densitatii lanturilor glucidice care il formeaza. Ca metoda specifica prezentam citochimia ultrastructurala cu lectine. Lectinele sunt proteine, sau glicoproteine ce leaga specific structuri glucidice, au cel putin doua situri de legare identice si nu sunt de origine imuna (adica nu sunt anticorpi impotriva unor epitopi ce contin glucide). Lectinele mai sunt cunoscute si sub denumirea de aglutinine deoarece, multumita capacitatii lor de a interactiona cu structurile glucidice, cat si datorita faptului ca prezinta cel putin doua situri identice de legare, pot aglutina celulele sanguine. Lectinele au fost initial identificate si extrase din plante ; ulterior activitati de tip lectinic au fost evidentiate si in organismele animale, fiind implicate intr-o multitudine de procese celulare (vezi cateva exemplificari mai jos la Rolul glicocalixului).
|
|  |
|
Rezulta ca la nivelul glicocalixului ConA nu se leaga de Glc aceasta nefiind situata in pozitie terminala. Lectina I din Ulex europaeus (UEA I), care recunoaste -Fuc aflata in pozitie terminala a lantului oligozaharidic. Lectina din Dolichos biflorus (DBA) interactioneaza cu structuri ce contin GalNAc legata de o alta GalNAc. O alta lectina ce leaga GalNAc, insa inserata pe o Gal este cea din Helix pomatia (HPA). Pentru Gal sunt folosite lectina din arahide (PNA) si / sau lectina I Ricinus communis (RCA I). Specificitatile celor doua lectine sunt insa diferite. PNA se leaga exclusiv de Gal aflata in pozitie terminala, in timp ce RCA I poate recunoaste si Gal aflata in pozitie subterminala, daca acidul sialic terminal este inserat la hidroxilul de la carbonul sase al acesteia. Mai mult ambianta in care galactoza terminala se afla in cadrul secventei glucidice este diferita. Asadar specificitatiile celor doua lectine sunt nuantate. Au fost folosite doua lectine si pentru evidentierea citochimica a acizilor sialici. Acestea sunt lectina din germeni de grau (WGA) si lectina din Limulus polyphemus (LPA). Prima recunoaste acidul sialic N-A-O-diacetilat, dar si - GlcNAc. Cea de a doua se leaga de acizi sialici atat din categoria N-acetilati, cat si din categoria N-glicolilati.Nuantarile din specificitatile acestor lectine sunt bine cunoscute sub aspectul secventelor in care trebuie sa se afle glucidul determinant al specificitatii. Utilizarea lor aduce astfel informatii nu numai asupra prezentei si abundentei tipurilor de glucide din compozitia glicocalixului, dar si in ceea ce priveste caracterizarea partiala a structurilor oligozaharidice, a secventelor acestora.
|
|
|
|
In citochima ultrastructurala lectinele pot fi folosite sub forma nativa, sau cuplate la trasori electrono opaci (feritina, peroxidaza de hrean, hempeptizi, aur coloidal : vezi si informatiile de la lucrarile practice asupra membranei celulare). Folosirea in forma nativa a lectinelor implica utilizarea unor metode in doi pasi, numite metode in sandwich. La primul pas suprafata celulelor este incubata cu lectina aflata in exces in solutia folosita. Excesul este apoi indepartat, iar lectinele ramase, atasate specific de componente glucidice ale membranei (prin unul din siturile de legare), sunt vizualizate prin legarea de glicoproteine corespunzatoarecuplate cu trasori electrono opaci (prin legarea la siturile de interactiune ramase disponibile). Avantajul acestor metode este ca lectinele sunt folosite cu capacitatile de legare (afinitatea si specificitatea) nealterate. Afinitatea si specificitatea acestor unelte de studiu pot fi afectate in cazul folosirii unor conjugate lectina trasor electrono opac, datorita rectiilor chimice petrecute in timpul cuplarii, sau posibilelor impiedicari sterice care pot apare in conjugat. A fost folosita o mare gama de lectine pentru caracterizarea partiala a glicocalixului diverselor tipuri de celule. Amintesc aici pe cele mai des utilizate, cu glucidul +-determinant al specificitatii lor. Concanavalina A (Con A), o lectina din Concanavalia ensiformis, care leaga -Man din miezul trimanozidic al structurilor N-glicozidice, sau -Glc aflata in pozitie terminala.
|
| |
|
Cu cat spectrul lectinelor folosite este mai larg, cu atat imaginea asupra glicocalixului este mai detaliata. In plus combinarea acestor metode cu folosirea exo-, sau endo-glicozidazelor, pentru degradarea specifica secventiala, sau globala a lanturilor glucidice ,completeaza fericit caracterizarea citochimica a glicocalixului.Trebuie insa mentionat ca informatiile complete asupra structurilor glucidice ale glicocalixului le aduc tot metodele biochimice prin care putem segrega intre glicolipide, glicoproteine si proteoglicani, putem izola si caracteriza entitatile moleculare. Speranta in ceea ce priveste rezolvarea problemei caracterizarii glicocalixului si in general a biologiei glucidelor celulare o reprezinta biologia moleculara prin capacitatea de a identifica si modela bagajul enzimatic celular implicat Pentru a integra informatiile structurale prezentate mai sus, cu scopul de a intelege organizarea spatiala a glicocalixului putem rezuma ca acest invelis celular trebuie perceput ca o liziera, ca un lastaris din ce in ce mai des pe masura ce patrundem de la exterior catre bistratul lipidic. El se caracterizeaza prin eterogenitate compozitionala si de organizare, sporind asimetria membranelor, deoarece este prezent numai pe versantul extern. Aceasta organizare a sugerat si primele idei asupra functiilor glicocalixului.
|
|
|
